Beewair BW60L sistemi ve bu sistemin insan MERS Coronavirüsü içeren kapalı alanları bulaşıcı maddelerden arındırma kapasitesine ilişkin Etkililik testi raporu

1. Önsöz VirNext, VirPath laboratuvarının, Fransa ulusal influenza ve respiratuar virüsler referans merkezine ev sahipliği yapan teknoloji araştırma platformudur ve bir Dünya Sağlık Örgütü- Ulusal İnfluenza Merkezidir. VirNext, iç mekân havasını, yüzeyini ve suyu bulaşıcı maddelerden arındıran fiziksel, kimyasal ve biyolojik teknolojilerin değerlendirilmesinde uzmandır. Beewair Şirketi, VirPath laboratuvarından ve platformu olan VirNext’den, insan Middle East Respiratory Syndrome (Orta Doğu Solunum Sendromu) coronavirüsü (MERS-CoV) içeren kapalı alanları bulaşıcı maddelerden arındırmak üzere Beewair tarafından geliştirilen bir hava temizleyici sisteminin etkililiğini değerlendirmesini istemiştir. Bu değerlendirme, Paris’teki Institut Pasteur, RNA Virüsleri Ünitesi (GMVR), Moleküler Genetik başkanı Prof. Sylvie van der Werf ile koordinasyon halinde gerçekleştirilmiştir. Talep eden: Beewair 3 Allée de la Teppe 71850 CharnayLesMacon, Fransa İrtibat: Dr. Pierre-AlexandreDeveau Test Laboratuvarı: VirPath laboratuvarı VirNext Platformu Faculté de médecineRTHLaennec 2émeétage 7-11 rueGuillaume Paradin, 69372 Lyon codex 08, Fransa İrtibat: Dr. Vincent Moulés

 

2. Metodoloji Deney, mikroorganizmalar içeren kapalı bir alanı bulaşıcı maddelerden arındırmak üzere Beewair tarafından geliştirilen sistemin kapasitesinin değerlendirilmesine dayanır. Bu kapalı alan, mikroorganizmalar içeren yapay bir atmosferin iyi bir yeniden üretilebilirlikle oluşturulabildiği 1,7m3’lük bir nebulizasyon haznesi ile cisimleştirildi. Bu bulaşmış atmosferler, konsantre viral solüsyonların nebulizasyonu ile elde edilmektedir. Siklonik hareket kullanarak haznenin bütün hacminin emilmesiyle test numuneleri toplandı (Coriolis, Bertin Teknolojileri). MERS-CoV klinik izolatı (ref 201327C2-2/12/13) Institut Pasteur’dan alındı (Prof. Sylvie van der Werf, GMVR) (1). Hücre kültürü, enfeksiyon, viral amplifikasyon ve titrasyon için bu deneylerde kullanılan bütün protokoller Instititut Pasteur tarafından kuruldu ve referans verildi (2). Hasat alma aşaması sırasında, toplanan virüsler hücre kültürü ortamı içeren bir toplama tamponunda yeniden askıya alındı. Test edilecek hava dekontaminasyon sisteminin teknik özelliklerine göre UV dozları elde etmek için, entegre vantilatörlerin fonksiyonunun yokluğunda, UV lambaları her dekontaminasyon aşamasından10 dakika önce açılmıştır.

 

3. Beewair sisteminin etkililiğinin değerlendirilmesi

3.1 Deney koşulları

Tarih: 7 Temmuz 2014

Sıcaklık: 20°C

Beewair sisteminin akışı: 60 m3/saat

Hava işleme ve dekontaminasyon Beewair BW60L sistemi, 70 Wattlık (UVc 254 nm) bir küresel ışın saçma gücü ve 80.000 TeraRad’lık ortalama oksidasyon/mineralizasyon kapasitesi içeren DBD-Lyse modüllerini bütünleştiren teğetsel bir reaktörden oluşmaktadır.

 

İşleyiş zamanı:

Sistemin işleyiş zamanı, kapalı alandaki dekontaminasyon etkililiğini değerlendirmek için 3 (5,1 m3, 306 saniye) hazne hacminden, 8 hazne hacminden (13,6 m3, 816 saniye) ve 12 hazne hacminden (20,4 m3, 1224 saniye) geçtikten sonra tanımlanmıştır.

 

Nebulizasyon aşaması:

MERS CoV içeren yapay atmosfer, atmosfer başına 2.6E/ TCID50 ortalama sayısına karşılık gelen 15 dakika boyunca 5 çarpışma nebilüzörü (NSF 6 jet CN25, BGI USA) (Hava basıncı 1,7 bar, 24,6 psig) ile oluşturuldu. Teorik damlacık MMD değer, 1,9 μm’dir.

 

Numune adedi:

18 Viral solüsyon stok konsantrasyonu: MERS CoV: 107.3TCID50/mL Önceden tanımlandığı şekilde (3), %2 fetal dana serumu, 2mM L-glutamin (Sigma-Aldrich), Penisilin (225U/mL, Cambrex Biosciences ) ve streptomisin (225ug/mL, Cambrex Biosciences) ilave edilmiş Dulbecco’nun Modifiye Eagle Ortamı 4,5g/L glukoz içerisindeki maymun böbrek hücrelerinde 2 viral amplifikasyondan sonra viral stoku oluşturuldu. Vero E6 hücreleri 5’lik bir enfeksiyon multipüsitesi (MOI) içerisinde enfekte edildi ve üst fazlar enfeksiyondan 48 saat sonra hasat edildi.

 

Toplama parametreleri:

%2 fetal dana serumu, 2mM L-glutamin (Sigma-Aldrich), Penisilin (225U/mL, Cambrex Biosciences ) ve streptomisin (225ug/mL, Cambrex Biosciences) ilave edilmiş Dulbecco’nun Modifiye Eagle Ortamı 4,5g/L glukozun (LONZA Ref BE12-614F) 7 mL’sinde 7 dakika (200 L/dakika) boyunca virüsler toplandı.

 

Değerlendirme yöntemi:

Institut Pasteur’a göre kurulan protokol doğrultusunda, uç nokta titrasyon analiziyle viral enfeksiyöz titreler belirlendi (2). Kısaca, her numunenin 10 katlı seri seyreltilerinin 50mL’si, 37°C %5 CO2’de inkübe edilmiş, 96 çukurlu mikroplakalarda yetiştirilmiş Vero E6 hücrelerinin dört şahit kuyusuna aşılandı. Sitopatik etkinin varlığı enfeksiyondan 72 saat sonra izlendi. Viral enfeksiyöz titreler (TCID50/50uL), Reed & Muench istatistik yöntemi ile belirlendi (4).

Bibliyografya:

(1) Guery B(1), Poissy J, el Mansouf L, Séjourné C, Ettahar N, Lemaire X, Vuotto F, Goffard A, Behillil S, Enouf V, Caro V, Mailles A, Che D, ManuguerraJC, Mathieu D, Fontanet A, van der Werf S: MERS-CoVçalışmagrubu. Orta Doğu Solunum Sendromu corona virüslü iki enfeksiyon vakasının klinik özellikleri ve viral teşhisi: bir nozokomiyal geçiş raporu.Lancet. 29 Haziran 2013; 381 (9885):2265-72

(2) SOPs GMVR unit Institut Pasteur: <Inoculation des coronavirus sur cellules Vero E6> – version du 03/04/2014; α Titrage TCID50 – version du 04/06/2014

(3) de Wilde AH, Raj VS, Oudshoorn D, Bestebroer TM, van Nieuwkoop S, LimpensRW, Posthuma CC, van der Meer Y, Bárcena M, Haagmans BL, SnijderEJ, van den Hoogen BG. MERS-coronavirus replication induces severe in vitro cytopathology and is strongly inhibited by cyclosporine. A or interferon-α treatment. J Gen Virol 2013 Ağustos; 94 (Pt 8); 1749-60

(4) Reed L.J ;Muench. H. A simple method of extimating fifty percent endpoints, Am. J. Epidemiol (1938) 27 (3); 493-497

Yukarıdaki tabloda gösterildiği gibi, enfeksiyöz MERS-CoV titreleri, Beewair sisteminden geçiş ile önemli derecede azaltılmıştır.

Log 3TCID50/μL olarak ifade edilen viral titre azalması aşağıdaki gibi olmuştur:

• 306 saniye işleyiş süresi (5,1 m3) için 2,00 ± 0,00
• 816 saniye işleyiş süresi (13,6 m3) için 3,40 ± 0,03
• 1244 saniye işleyiş süresi (20,4 m3) için 3,90 ± 0,17

4. Sonuç

Beewair Şirketi tarafından geliştirilen BW60L, kapalı bir alandaki enfeksiyöz insan MERS CoV virüsünün, %99,99’dan fazla bir etkililikle etkin bir şekilde etkisizleştirilmesine ve 12 hava hacminin geçişi üzerine yaklaşık 104 kata kadar 3 hazneli hava hacimlerinin geçişi üzerine viral titrenin 100 katlı bir faktörle azalmasına yol açar.